植物乳桿菌胞外多糖的分離純化

乳酸菌作為食源性微生物具有被*的食用安全性，其在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的胞外多糖（exopolysaccharide，EPS）被廣泛應(yīng)用于食品生產(chǎn)、制藥、生物工程、生物絮凝劑以及化工生產(chǎn)領(lǐng)域 。常見的產(chǎn)胞外多糖乳酸菌主要有植物乳桿菌、嗜熱鏈球菌、雙歧桿菌等 。近年來，越來越多不同來源的產(chǎn)胞外多糖乳酸菌被分離出來，并得到了深入的研究。與植物多糖相比，乳酸菌胞外多糖具有*的理化特性，如低質(zhì)量濃度時(shí)的高黏度、濃稠特性，剪切稀釋特性等，這主要是由于乳酸菌胞外多糖的單糖組成、單糖之間糖苷鍵連接位點(diǎn)、糖鏈分支結(jié)構(gòu)等的不同造成的。

乳酸菌胞外多糖的結(jié)構(gòu)特性除了與菌株自身的遺傳因素相關(guān)外，環(huán)境因素如培養(yǎng)基的碳源、氮源、菌株的生長溫度等也有較大的影響。此外，乳酸菌胞外多糖也存在一些共同的特征，如乳酸菌胞外多糖一般由葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、甘露糖、氨基糖等組成；大多數(shù)乳酸菌胞外多糖具有較好的親水性；許多細(xì)菌胞外多糖由于可以在水相和油相之間形成穩(wěn)定的乳化液，因此可以作為生物乳化劑應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中 。

關(guān)于乳酸菌胞外多糖的研究大多數(shù)采用基于全脂乳的培養(yǎng)基或合成、半合成培養(yǎng)基，如乳酸細(xì)菌培養(yǎng)基、史娃茲鑒別培養(yǎng)基等，然而這些培養(yǎng)基在發(fā)酵過程中易形成絡(luò)合物，對(duì)胞外多糖的生成和量化有一定的影響 。本研究采用基于脫脂乳的培養(yǎng)基，對(duì)本課題組從西藏靈菇中分離到的兩株植物乳桿菌（菌株YW11和菌株SKT109）在生長過程中產(chǎn)生的胞外多糖進(jìn)行分離純化，研究純化胞外多糖的理化性質(zhì)，為其進(jìn)一步工業(yè)化應(yīng)用開發(fā)提供技術(shù)支持。

1　材料與方法

1.1　菌種與試劑

植物乳桿菌YW11（NCBI：KM265361）、植物乳桿菌SKT109（NCBI：KJ764641），均保存于北京工商大學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

三氯已酸（trichloroacetic，TCA）、濃硫酸、重蒸酚、無水乙醇、十六烷、間羥聯(lián)苯、四硼酸鈉（均為分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；脫脂乳粉新西蘭恒天然乳品有限公司；離子交換柱填料 DEAESepharose Fast Flow 英國Waterman公司；Sepharose CL-6B層析柱填料 瑞典Amersham Bioscience公司；透析袋（8 000～14 000 D） 北京鼎國生物技術(shù)有限公司。

脫脂乳培養(yǎng)基：葡萄糖20.0 g、脫脂乳粉12.5 g，去離子水1 L，攪拌均勻后置于95 ℃滅菌15 min。

1.2　儀器與設(shè)備

CR21GⅢ立式高速冷凍離心機(jī)、U3900紫外分光光度計(jì) 日本Hitachi公司；MLS-3750高壓蒸汽滅菌器日本三洋公司；BX53電子顯微鏡 日本奧林巴斯公司；ALV/CGS-3一體式光散射儀 德國ALV公司；Nexus470紅外光譜儀 美國Nicolet公司；5975C型氣相色譜儀美國安捷倫公司；XHF-DY高速勻漿機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3　植物乳桿菌胞外多糖的分離純化

1.3.1　粗多糖的制備

將植物乳桿菌連續(xù)活化兩代后轉(zhuǎn)接至脫脂乳培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)16 h，然后加入80%TCA至其在發(fā)酵液中最終質(zhì)量濃度為4 g/L。常溫下攪拌2 h，4 ℃、10 000 r/min離心45 min去除發(fā)酵液　中的細(xì)胞和蛋白。取上清液，加入兩倍體積的無水乙醇，4 ℃冷藏12 h，再于4 ℃、10 000 r/min離心30 min。采用去離子水復(fù)溶沉淀物，并移入透析袋，每8 h換一次去離子水，透析24 h后冷凍干燥得到粗多糖。

1.3.2　DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換柱層析純化

配制20 mg/mL的粗多糖溶液，經(jīng)DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換柱層析（2.6 cm×40 cm）純化，進(jìn)樣5 mL，線性梯度洗脫，1～30 管用去離子水、31～60 管用0.2 mol/L NaCl溶液、61～100 管用0.5 mol/L NaCl溶液，控制洗脫速率為1 mL/min，自動(dòng)集樣，每管收集5 min，檢測(cè)多糖含量，合并收集單一峰組分，透析，冷凍干燥。

1.3.3　Sepharose CL-6B凝膠柱層析純化

經(jīng)離子交換層析得到的多糖組分用質(zhì)量濃度9 g/L的NaCl溶液溶解后，上樣至Sepharose CL-6B凝膠柱層析（2.5 cm×50 cm），進(jìn)樣量5 mg，進(jìn)樣量2 mg/mL。采用9 g/L的NaCl溶液洗脫，洗脫速率為0.5 mL/min，每管收集5 mL，檢測(cè)每管多糖含量，按多糖含量檢測(cè)值分別合并收集單一峰組分，去離子水透析，冷凍干燥，獲得EPS純品。

1.4　植物乳桿菌胞外多糖的理化特性

1.4.1　多糖的基本理化性質(zhì)

總糖含量：采用苯酚-硫酸法；多糖中蛋白質(zhì)含量：采用考馬斯亮藍(lán)比色法；糖醛酸含量：采用間羥聯(lián)苯法；水分含量：采用稱質(zhì)量法。

1.4.2　紅外光譜測(cè)定

準(zhǔn)確稱取2 mg EPS，KBr壓片，使用Nexus 470紅外光譜儀測(cè)定。

1.4.3　EPS動(dòng)態(tài)光散射分析

配制0.1 mol/L NaNO 3溶液，將EPS溶解到NaNO 3溶液中，質(zhì)量濃度為0.5 g/L。輕輕攪動(dòng)至*溶解。過0.22 μm濾膜，置于無塵處理過的石英散射池（25 mm）中，使用ALV/CGS-3一體式光散射儀測(cè)定EPS流體力學(xué)半徑R h。散射角為90°，功率22 mW，波長：632.8 nm。

1.4.4　胞外多糖的單糖組成分析

多糖的酸水解與單糖衍生化參考王輯研究方法，單糖標(biāo)準(zhǔn)品為鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖、果糖、巖藻糖。色譜條件：色譜柱類型，DB-5毛細(xì)管柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；進(jìn)樣量1 μL；氧火焰離子檢測(cè)器；載氣流速：1 mL/min；分流比：1∶30；升溫程序：80 ℃保持3 min，5 ℃/min升至195 ℃保持1 min，5 ℃/min升至215 ℃保持1 min，10 ℃/min升至230 ℃保持3 min。

1.4.5　胞外多糖乳化特性測(cè)定

1.4.5.1　不同質(zhì)量濃度胞外多糖乳化能力的測(cè)定

取不同質(zhì)量濃度（0.5～2.5 g/L）的胞外多糖水溶液2 mL，加入　3 mL橄欖油，使用高速勻漿機(jī)3 600 r/min均質(zhì)2 min，轉(zhuǎn)移到刻度試管中，分別于24、168、360 h測(cè)定并按式（1）計(jì)算乳化指數(shù)（E），表示為E 24、E 168、E 360。

式中：h e為乳化層高度/cm；h t為總高度/cm。

1.4.5.2　胞外多糖與其他乳化劑的協(xié)同效應(yīng)

分別將質(zhì)量濃度為1.0 g/L的胞外多糖和質(zhì)量濃度為0.5 g/L的刺槐膠、黃原膠、海藻酸鈉或瓜爾豆膠按質(zhì)量比1∶1混合，取混合液2 mL加入3 mL橄欖油，均質(zhì)，測(cè)定168 h時(shí)的乳化指數(shù)（E 168）。

1.4.5.3　乳化穩(wěn)定性的測(cè)定

質(zhì)量濃度1.0 g/L的EPS水溶液和質(zhì)量濃度0.5 g/L的其他乳化劑（刺槐膠、海藻酸鈉、黃原膠、瓜爾豆膠）溶液按質(zhì)量比1∶1混合，分別取混合液2 mL，加入0.5 mL十六烷，旋渦振蕩1 min，分別在旋渦振蕩前、后迅速測(cè)定混合液540 nm波長處吸光度（A 0）。振蕩后的混合液在室溫條件下靜置30 min后，測(cè)定540 nm波長處吸光度的降低值（A t）。按公式（2）計(jì)算乳化穩(wěn)定性。

1.4.5.4　乳化顆粒的粒徑大小及分布

制備質(zhì)量濃度1.0 g/L的胞外多糖乳化液，室溫靜置24　h后取60 μL乳化液，置于顯微鏡（100×）下觀察并拍照，乳化顆粒的大小及分布情況，通過Image Pro Plus軟件分析，乳化顆粒度半徑及分布通過SPSS 21.0軟件繪制直方圖進(jìn)行分析。

1.5　數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)樣品3 次平行，以±s表示，SPSS 21.0軟件進(jìn)行方差分析，P＜0.05表示差異顯著。

2　結(jié)果與分析

2.1　植物乳桿菌胞外多糖的分離提純

植物乳桿菌菌株YW11和菌株SKT109分別于脫脂乳培養(yǎng)基中培養(yǎng)，經(jīng)TCA除蛋白、離心、乙醇沉淀、透析、冷凍干燥后得到胞外多糖粗品。此兩種粗多糖用于進(jìn)一　步純化。

2.1.1　DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換柱層析

菌株YW11和菌株SKT109粗多糖經(jīng)離子交換柱的洗脫曲線如圖1所示。YW11胞外多糖的洗脫峰出現(xiàn)在以0.5 mol/L的NaCl溶液作為洗脫液時(shí)（圖1A），表明此胞外多糖帶有電荷，為酸性多糖。SKT109胞外多糖的洗脫峰出現(xiàn)在以水作為洗脫液時(shí)（圖1B），表明此組分不帶電荷，為中性多糖。分別收集洗脫峰，經(jīng)透析、冷凍干燥后得到蓬松狀、白色的SKT109胞外多糖和YW11胞外多糖樣品。

圖1　DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換柱層析純化植物乳桿菌菌株YW11（A）和菌株SKT109（B）EPS洗脫曲線 

2.1.2　Sepharose CL-6B凝膠柱層析

圖2　Sepharose CL-6B凝膠柱層析純化植物乳桿菌胞外多糖EPSEPS YW11YW11（A）和EPSEPS SKT109KT109（B）的洗脫曲線 

由于離子交換柱分離得到的多糖樣品可能含有帶相同電荷的不同組分，因此，需進(jìn)一步采用凝膠層析按各組分分子質(zhì)量的不同分離純化。兩種多糖樣品經(jīng)Sepharose CL-6B凝膠柱層析（圖2），分別得到多糖的單一峰（圖2A、B），經(jīng)透析和冷凍干燥獲得該兩種多糖的純品，分別記為EPS YW11和EPS SKT109，用于以下的實(shí)驗(yàn)。對(duì)此兩種多糖純品的進(jìn)一步分析表明，經(jīng)過純化后的EPS SKT109和EPS YW11中的總糖含量分別為92.31%、89.02%，純度較高；蛋白質(zhì)含量分別為1.25%、1.01%；糖醛酸含量分別為0%、5.44%。兩種多糖的水分含量均在4%左右。

2.2　植物乳桿菌胞外多糖的主要單糖組成

單糖標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間從左到右依次為鼠李糖（26.203 min）、巖藻糖（26.406 min）、阿拉伯糖（26.499 min）、木糖（26.904 min）、果糖（31.503 min）、葡萄糖（31.726 min）、半乳糖（31.891 min）。EPS YW11在保留時(shí)間為31.787 min和31.901 min時(shí)出峰，表明EPS YW11主要由葡萄糖和半乳糖兩種單糖構(gòu)成，EPS SKT109在保留時(shí)間為31.726 min和31.896 min時(shí)出峰，表明該EPS也由葡萄糖和半乳糖構(gòu)成。通過面積歸一化法定量分析可得，EPS YW11中葡萄糖與半乳糖物質(zhì)的量比為3.45∶1，EPS SKT109中葡萄糖與半乳糖物質(zhì)的量比為1.43∶1。Zhang Li等報(bào)道植物乳桿菌C88胞外多糖的單糖組成為葡萄糖和半乳糖（物質(zhì)的量比為2∶1）。不同植物乳桿菌胞外多糖的單糖組成存在差異可能與產(chǎn)糖菌株、培養(yǎng)基類型和發(fā)酵條件有關(guān)。

2.3　植物乳桿菌胞外多糖的紅外光譜分析

在3 294.2 cm －1（EPS YW11）和3 361.7 cm －1（EPS SKT109）處存在寬展圓滑的強(qiáng)吸收峰是由羥基伸縮振動(dòng)造成的，表明多糖分子中存在大量的羥基。在2 968.3 cm －1（EPS YW11）和2 875.4 cm －1（EPS SKT109）處存在一個(gè)弱峰，歸屬于多糖分子中—CH 2的C—H伸縮振動(dòng)，是多糖的特征吸收峰。在1 647.7 cm －1（EPS YW11）處存在一個(gè)強(qiáng)吸收峰，可能與胞外多糖中環(huán)狀結(jié)構(gòu)的C＝O伸縮振動(dòng)有關(guān)，在1 675.3 cm －1（EPS SKT109）處存在一個(gè)中強(qiáng)吸收峰，可能與C＝C伸縮振動(dòng)有關(guān)，Wang Jing等研究發(fā)現(xiàn)，此處出現(xiàn)紅外吸收峰可能是由于半乳糖或甘露糖的存在造成的，進(jìn)一步驗(yàn)證了兩種多糖的單糖組成中存在半乳糖。在1 539.4 cm －1（EPS YW11）和1 581.3 cm －1（EPS SKT109）處存在弱的吸收峰，可能與N—H的彎曲振動(dòng)有關(guān)，此峰可能是多糖中存的少量蛋白質(zhì)造成的。在反應(yīng)胞外多糖等高聚物的精細(xì)結(jié)構(gòu)的指紋區(qū)（1 500～500 cm －1），吸收峰1 231.4 cm －1（EPS YW11）和1 291.4 cm －1（EPS SKT109）的出現(xiàn)可能與酯基存在有關(guān)，表明多糖結(jié)構(gòu)中可能會(huì)出現(xiàn)CH 3COOR，Ai Lianzhong等對(duì)干酪乳桿菌LC2W胞外多糖的研究也有類似報(bào)道。

2.4　植物乳桿菌胞外多糖的動(dòng)態(tài)光散射分析

動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)具有對(duì)樣品無干擾、測(cè)量信息量大、易操作、分析速度快等優(yōu)點(diǎn)，采用該項(xiàng)技術(shù)直接測(cè)定得到的高聚物分子流體力學(xué)半徑（R h）能夠反映大分子在溶液中的尺寸，是研究高聚物流變特性的重要參數(shù)。通過ALV/CGS-3一體式光散射儀測(cè)定得到EPS YW11和EPS SKT109在NaNO 3溶液中的R h值分別為69.20 nm和41.74 nm。這與Shao Li等研究鼠李糖乳桿菌KF5胞外多糖的R h（59.4 nm）相接近。Schmitt等研究發(fā)現(xiàn)，溶液中大分子顆粒尺寸的差異可能會(huì)導(dǎo)致其不同的界面特性，一定范圍內(nèi)顆粒粒徑越大，能夠更有效地保持流體界面的穩(wěn)定性。

2.5　植物乳桿菌胞外多糖的乳化特性

2.5.1　多糖質(zhì)量濃度對(duì)其乳化能力的影響

表1　不同質(zhì)量濃度EPS YW11和EPS SKT109的乳化指數(shù) 

注：同行肩標(biāo)小寫字母不同表示差異顯著（P＜0.05）；同列肩標(biāo)大寫字母不同表示差異顯著（P＜0.05）。

EPS SKT109E 24/%E 168/%E 360/%E 24/%E 168/%E 360/% 0.525.36±1.65 cD24.12±0.70 cD24.03±1.08 bD66.67±1.03 eA64.66±0.83 cB53.33±0.21 cC1.085.43±1.13 bA46.35±0.85 bE35.52±0.83 aF68.75±0.95 dB62.51±0.75 dC53.33±0.27 cD1.587.20±0.92 bA47.21±0.63 bE33.23±0.36 aF76.67±0.14 cB59.26±1.21 eD62.5±1.34 bC2.088.17±1.96 bA48.86±1.11 aE34.38±0.08 aF80.65±0.72 bB70.97±0.59 bC62.53±1.16 bD2.593.01±2.29 aA50.09±0.92 aE36.26±0.76 aF83.33±1.21 aB76.67±0.36 aC66.67±1.01 aD質(zhì)量濃度/（g/L）EPS YW11

EPS YW11和EPS SKT109在不同質(zhì)量濃度（1.0～2.5 g/L）下的乳化指數(shù)及其隨時(shí)間延長的乳化穩(wěn)定性如表1所示。在相同質(zhì)量濃度下，EPS YW11的乳化指數(shù)（　E 24）均明顯高于EPS SKT109，表明EPS YW11的乳化能力強(qiáng)于EPS SKT109，這可能是由于在乳化初期，酸性多糖EPS YW11除了親水基團(tuán)的作用外，其他帶電粒子與橄欖油中帶相反電荷的基團(tuán)相互作用，形成雙分子層，加強(qiáng)了油滴之間的靜電相互作用，從而增強(qiáng)了多糖的乳化能力。另一方面，EPS YW11的R h大于EPS SKT109的R h，可能增強(qiáng)了其界面穩(wěn)定性，因而導(dǎo)致乳化能力提高。

隨著多糖的質(zhì)量濃度從0.5 g/L增加到2.5 g/L，此兩種胞外多糖的乳化指數(shù)具有不同程度的增加，酸性胞外多糖EPS YW11的乳化指數(shù)（E 24）增加幅度最大，從25.94%增加到93.08%；而中性胞外多糖EPS SKT109的乳化指數(shù)增加幅度較小，從66.67%增加到83.33%。Han Yuzhu等研究發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌LPL061胞外多糖在質(zhì)量濃度為1.0 g/L時(shí)表現(xiàn)出較好的乳化特性，表明胞外多糖只有在到達(dá)一定的質(zhì)量濃度時(shí)，才能起到較好的乳化作用。本研究中，植物乳桿菌EPS YW11和EPS SKT109在質(zhì)量濃度為2.5 g/L時(shí)呈現(xiàn)較好的乳化特性。這可能是由于多糖質(zhì)量濃度的增加，可導(dǎo)致整個(gè)體系黏度的增加，同時(shí)多糖分子中親水官能團(tuán)（—CH 2等）的存在對(duì)多糖的乳化性起到一定的促進(jìn)作用。

2.5.2　植物乳桿菌胞外多糖與不同乳化劑的協(xié)同效應(yīng)

不同乳化能力的乳化劑混合，可以導(dǎo)致形成的乳化液的界面膜強(qiáng)度增加，而高強(qiáng)度的界面膜是形成穩(wěn)定乳化液的原因之一。本實(shí)驗(yàn)以乳化指數(shù)（E 168）作為指標(biāo)，研究了EPS YW11和EPS SKT109與其他4 種親水乳化劑的協(xié)同效應(yīng)；以乳化穩(wěn)定性為指標(biāo)，研究了此乳化協(xié)同效應(yīng)的穩(wěn)定性，結(jié)果如表2所示。EPS YW11與黃原膠復(fù)配時(shí)，乳化指數(shù)（E 168）達(dá)到89.58%，乳化能力較好，而與其他乳化劑復(fù)配時(shí)的乳化能力較單獨(dú)使用EPS YW11（46.35%）的差異相對(duì)較小。EPS SKT109與刺槐膠或瓜爾豆膠復(fù)配時(shí)，乳化指數(shù)（E 168）分別為79.41%和76.47%，乳化能力較單獨(dú)使用EPS SKT109（62.51%）有所提高，而當(dāng)EPS SKT109與海藻酸鈉和黃原膠復(fù)配時(shí)，乳化指數(shù)顯著降低，一方面可能是由于多糖與凝膠復(fù)配后，協(xié)同體系的質(zhì)量濃度較大，多余的乳化劑因絮凝作用導(dǎo)致顆粒聚集下沉，另一方面是由于協(xié)同效應(yīng)影響乳化顆粒粒徑，從而導(dǎo)致乳化體系失衡。EPS YW11與黃原膠復(fù)配時(shí)其乳化穩(wěn)定性為61%，而與其他乳化劑混合乳化時(shí)，乳化穩(wěn)定性都偏高，這表明在EPS YW11與黃原膠復(fù)配時(shí)，表現(xiàn)了較好的乳化穩(wěn)定性。EPS SKT109在　與刺槐膠和瓜爾豆膠復(fù)配時(shí)，乳化穩(wěn)定性為83%和75%，也表現(xiàn)出了相對(duì)較好的乳化穩(wěn)定性。注：同列肩標(biāo)小寫字母不同表示差異顯著（P＜0.05）。

表2　EPS YW11和EPS SKT109與不同乳化劑的協(xié)同效應(yīng) 

組別（質(zhì)量濃度/（g/L））E 168/%乳化穩(wěn)定性/% EPS YW11EPS SKT109EPS YW11EPS SKT109EPS（1.0）　46.35±0.85 d62.51±0.75 c8176 EPS（1.0）＋刺槐膠（0.5）69.82±0. 98b79.41±0.98 a8083 EPS（1.0）＋海藻酸鈉（0.5）40.35±1.03 e30.56±1.26 d8993 EPS（1.0）＋黃原膠（0.5）89.58±0.58 a32.35±1.02 d6173 EPS（1.0）＋瓜爾豆膠（0.5）59.35±2.01 c76.47±0.68 b6975

3　結(jié) 論

本研究對(duì)植物然桿菌YW11和SKT109在基于脫脂乳培養(yǎng)基中發(fā)酵產(chǎn)生的胞外多糖進(jìn)行了分離純化，分別獲得了酸性多糖EPS YW11和中性多糖EPS SKT109純品。此兩種胞外多糖的紅外光譜均存在多糖的特征吸收峰；其單糖組成均為葡萄糖和半乳糖，但兩種單糖的物質(zhì)的量比不同。對(duì)EPS YW11和EPS SKT109乳化特性的研究表明，二者均可形成相對(duì)較小的乳化顆粒，呈現(xiàn)良好的乳化特性；EPS SKT109乳化顆粒半徑略低于EPS YW11，前者具有相對(duì)更好的乳化穩(wěn)定性。

同時(shí)，兩種胞外多糖與常用的乳化劑具有不同程度的乳化協(xié)同效應(yīng)，其中EPS YW11與黃原膠復(fù)配時(shí)的協(xié)同效應(yīng)明顯，且具有較好的乳化穩(wěn)定性。本研究獲得的植物乳桿菌胞外多糖EPS YW11和EPS SKT109在食品工業(yè)中具有潛在的應(yīng)用開發(fā)前景。

相關(guān)鏈接：植物乳桿菌，脫脂乳培養(yǎng)基，多糖，糖醛酸，干酪乳桿菌，北納生物

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