細胞生長的檢查方法（一）

1.直接計數(shù)法

是zui簡單的檢測細胞生長的方法。計數(shù)細胞一般利用臺盼藍(錐蟲藍染色，臺盼藍(錐蟲藍)不能透過活細胞正常完整的細胞膜，故活細胞不著色。而死亡細胞的細胞膜通透性增高，可使染料進入細胞內(nèi)而使細胞著色。因此，鏡下未染色細胞認為是活細胞，而染色細胞認為是死亡細胞。

經(jīng)典的細胞計數(shù)常用到血細胞計數(shù)板。細胞消化成單個細胞后，將細胞懸液加入血蓋片和計數(shù)板之間的空隙中，通常我們計數(shù)計數(shù)板的四角大方格(每個大方格又分16個小方格)內(nèi)的細胞數(shù)。計完數(shù)后，需換算出每ml懸液中的細胞數(shù)。由于計數(shù)板中每一方格的面積為0. 01cm²，高為0. 01cm，這樣它的體積為0. 0001cm³，即0.1mm³。由于1ml=1000mm³，所以每一大方格內(nèi)細胞數(shù)×10 000=細胞數(shù)／ml，可按下式計算：細胞懸液細胞數(shù)／ml=4個大格細胞總數(shù)／4×10000。如計數(shù)前己稀釋，可再乘稀釋倍數(shù)。計數(shù)細胞后，可以根據(jù)細胞計數(shù)結(jié)果，以細胞數(shù)為縱坐標，以天數(shù)為橫坐標繪制生長曲線。

目前也有多家公司生產(chǎn)自動細胞計數(shù)儀，如lifetechnology、Bio-rad等公司。自動計數(shù)儀將圖像輸入電腦后自動計數(shù)，消除了手動細胞計數(shù)的主觀性，消除了用戶之間的差異性，可以快速準確地計數(shù)細胞，并同時檢測細胞存活率及平均大小。隨著技術(shù)的不斷進步，有公司也推出了直接計數(shù)細胞的分析儀器，如Roche旗下Innovatis公司的CASY系列細胞計數(shù)分析系統(tǒng)，CASY細胞計數(shù)儀采用*的電脈沖三維掃描分析技術(shù)。它突破了傳統(tǒng)二維細胞成像分析技術(shù)和染色法的局限，提供更加的細胞計數(shù)和分析功能。無需購買染色劑，即可、快速地定量細胞濃度、體積、成團和碎片。它根據(jù)測量的體積來計算細胞成團，即使是嚴重成團的細胞，它也能正確定量。細胞死亡時，細胞膜會破損，CASY測得的是細胞核的體積，根據(jù)體積大小的差別，我們可以區(qū)分活細胞、死細胞以及細胞碎片。

2.檢測DNA合成

檢測DNA合成是目前檢測細胞增殖zui準確可靠的方法，目前常用的方法有如下幾種：

(1)³H-胸腺嘧啶核苷滲入法(³H-TdR)：胸腺嘧啶核苷(TdR)是DNA合成的前體物，處于S期的細胞不斷地攝取TdR用以合成DNA。³H-TdR摻入法是將被放射性標記的³H-TdR摻入DNA合成期的細胞，細胞內(nèi)³H-TdR摻入量的多少可客觀反映細胞復(fù)制DNA能力的大小，從而問接了解細胞增殖情況。通過檢測。H放射活性即可反映DNA含量。

1976年Mattem等首先采用此方法做體外藥敏試驗。此后經(jīng)過長期的廣泛研究，也己證實該法對各種動物腫瘤及人類腫瘤均有較好的預(yù)測價值和重復(fù)性，主要用于細胞增殖的檢測與藥物敏感性試驗等。但這種方法操作復(fù)雜，試劑含有同位素，具有放射性，對實驗者有一定的危害，故限制了它的應(yīng)用。

(2)BrdU檢測法：BrdU中文全名為5-溴脫氧尿嘧啶核苷，為胸腺嘧啶的衍生物，可代替胸腺嘧啶在DNA合成期(S期)摻入，而后利用抗BrdU的抗體耦聯(lián)不同的酶，加入不同發(fā)光特性的底物，然后再通過比色法、化學(xué)發(fā)光檢測或熒光信號檢測底物強度等步驟，反映BrdU的摻入量。該方法不需要再和放射性物質(zhì)打交道。

(3)EdU檢測法：BrdU雖然解決了接觸同位素的問題，但該方法需要變性DNA后才能與抗體結(jié)合，但這就破壞了DNA雙鏈結(jié)構(gòu)，對某些后續(xù)或同時進行的試驗，如其他染料的結(jié)合染色有影響?，F(xiàn)在有一種新的檢測方法能避免這種情況的發(fā)生——EdU檢測。EdU(5-乙炔基-2’脫氧尿嘧啶核苷)也是一種胸腺嘧啶核苷類似物，但其連有的炔羥基團在天然化合物中很少見，在細胞增殖時能夠插入正在復(fù)制的DNA分子中，基于EdU與染料的共軛反應(yīng)可以進行快速的細胞增殖檢測分析，可以有效地檢測處于S期的細胞百分數(shù)。與傳統(tǒng)的免疫熒光染色(BrdU)檢測方法相比，更簡單，更快速，更準確。